Laboratoriumresultaten: Polymerasekettingreactie (PCR)

2023 Auteur: Wallace Forman | [email protected]. Laatst gewijzigd: 2023-05-24 12:25

Laboratoriumresultaten: polymerasekettingreactie (PCR)

De polymerasekettingreactie (PCR) is de belangrijkste laboratoriummethode om de fijne moleculaire structuur van genetisch materiaal te onderzoeken. Dit bestaat uit deoxyribonucleïnezuur (DNA), dat de genetische code van mensen opbouwt, maar ook van dieren en planten.

In de menselijke geneeskunde wordt PCR gebruikt om erfelijke ziekten en genetische problemen op te helderen (ziekterisico, vaderschapstest, enz.), Maar ook bij de diagnose van talrijke infectieziekten. In de context van de opheldering van infectieziekten, in tegenstelling tot serologische diagnostiek (bepaling van antilichamen tegen de pathogenen in het bloed), vertegenwoordigen PCR-methoden een directe medische laboratoriumdetectiemethode.

Enerzijds is het voordeel van PCR de snelle beschikbaarheid van de testresultaten. Bovendien zijn de PCR-methoden meestal erg gevoelig.

navigatie

• Lees verder
• meer over het onderwerp
• Advies, downloads & tools
• Wat is de polymerasekettingreactie (PCR) en wat wordt deze onderzocht?
• Hoe werkt de PCR?
• Welke testresultaten levert de PCR op?
• Zijn er verdere ontwikkelingen in conventionele PCR?
• Wat zijn de belangrijkste toepassingsgebieden voor PCR?
• Zijn er referentiewaarden voor PCR-testresultaten?

Dit betekent dat zelfs de kleinste hoeveelheden genetisch materiaal van een ziekteverwekker (bacteriën, virussen, etc.) binnen de detectieperiode van het betreffende pathogeen in het overeenkomstige testmateriaal tot een betrouwbaar positief resultaat leiden. Voornamelijk bloed, maar ook andere lichaamsvloeistoffen (sputum, urine, sterke drank, etc.) worden gebruikt als onderzoeksmateriaal voor PCR-methoden.

Wat is de polymerasekettingreactie (PCR) en wat wordt deze onderzocht?

De polymerasekettingreactie ("Polymerase Chain Reaction" - PCR) is de belangrijkste laboratoriummethode om de fijne moleculaire structuur van genetisch materiaal te onderzoeken. Om deze reden wordt deze onderzoeksprocedure ook wel zogeheten

"Moleculaire diagnostiek"

De basis van het genetisch materiaal (ook wel 'genetisch materiaal' genoemd) is een speciaal molecuul met een lange keten:

het "DNA" (deoxyribonucleïnezuur)

Bij mensen bevindt het genetisch materiaal dat bestaat uit dubbelstrengs DNA (twee complementaire strengen) zich in de kern van alle lichaamscellen, waarbij alle lichaamscellen van een individu identiek genetisch materiaal hebben. Bovendien is de exacte samenstelling van de individuele genetische samenstelling van elke persoon uniek - vergelijkbaar met de vingerafdruk, die ook uniek is voor elke persoon.

Om deze reden wordt het erfelijk materiaal ook wel genoemd

"Genetische code" betekent dat de blauwdruk van alle lichaamsstructuren van een persoon in deze gecodeerde vorm in kaart wordt gebracht en op deze manier wordt opgeslagen en kan worden doorgegeven

Binnen de celkernen van de lichaamscellen bevindt het DNA zich in een speciale volgorde die bekend staat als

"Chromosomen" (erfelijke lichamen) wordt genoemd. Bij mensen komen deze altijd in paren voor in de lichaamscellen, de ene wordt geërfd van de moeder en de andere van de vader. In die zin bevatten alle lichaamscellen van een persoon in totaal 46 chromosomen - 22 paar zogenaamde autosomen en één paar zogenaamde geslachtschromosomen

Met behulp van de laboratoriummethode van PCR kan enerzijds de fijne structuur van menselijk DNA worden onderzocht, wat belangrijk is voor het diagnosticeren van ziekten of voor het verhelderen van specifieke vragen:

• Verduidelijking van erfelijke ziekten,
• Beoordeling van het ziekterisico,
• Onderzoek naar aangeboren eigenaardigheden van het metabolisme,
• forensische (zogenaamde "forensische") analyse (bijv. bewijs van vaderschap) en nog veel meer

Aan de andere kant hebben mensen niet alleen een overeenkomstige genetische samenstelling, maar eigenlijk hebben alle levensvormen op aarde een specifieke genetische samenstelling:

• Dieren,
• Planten,
• Paddestoelen,
• Bacteriën,
• Virussen,
• Parasieten etc.

De genetische opbouw van deze levensvormen bestaat ook voornamelijk uit DNA of, in het geval van sommige virussen, ook uit RNA (ribonucleïnezuur), dat in tegenstelling tot DNA enkelstrengs is. In de medische diagnostiek wordt PCR daarom ook gebruikt om tal van infectieziekten op te helderen:

• bacteriële infecties (bijv. tuberculose, bacteriële seksueel overdraagbare aandoeningen),
• virale infecties (bijv. virale hepatitis, HIV-infectie),
• parasitaire infecties (bijv. malaria) en nog veel meer

Hoe werkt de PCR?

De PCR-methode is in 1983 ontwikkeld door de Amerikaanse biochemicus Kary B. Mullis en is in wezen gebaseerd op twee principes:

• Vermenigvuldiging ("amplificatie") ook van een klein deel van het genetisch materiaal (DNA of RNA)
• Detectie en identificatie van de vermenigvuldigde ("versterkte") producten van de versterking.

De volgende componenten zijn daarom nodig om een PCR uit te voeren:

• een testmateriaal (bijv. bloed-, cel- of weefselmonsters),
• bepaalde reagentia ("polymerase", "primer", "nucleotiden" [dit zijn de DNA-bouwstenen] enz.) en laboratoriumapparatuur voor de amplificatie van het genetisch materiaal ook
• een detectiesysteem voor de PCR-producten.

Wat betreft de reagentia en laboratoriumapparatuur die nodig zijn om een PCR uit te voeren, vormt het volgende enzym de kern van het hele PCR-proces:

het Taq-polymerase

Dit is een enzym dat wordt verkregen uit het micro-organisme "Thermus aquarius" (Taq) - een bacteriestam die voorkomt in de buurt van hete, vulkanische bronnen en kan overleven aangepast aan de hoge temperaturen van zijn omgeving.

De specialiteit van Taq-polymerase is dat dit enzym ook zijn functie kan vervullen bij hoge temperaturen boven 50 ° Celsius (C), namelijk

de vermenigvuldiging ("amplificatie") van DNA

Naast het Taq-polymerase moet voorafgaand aan de PCR-analyse nauwkeurig worden gedefinieerd welk deel van het DNA moet worden onderzocht. Hiervoor heb je korte DNA-fragmenten nodig, waarvan de fijne structuur overeenkomt met het DNA-doelgebied met betrekking tot de respectievelijke genetische code (“DNA-sequentie). Deze DNA-fragmenten worden genoemd

"Primer" genoemd

Het eigenlijke versterkingsproces in de context van een PCR omvat tenslotte de volgende stappen:

• Extractie van het genetisch materiaal (DNA of RNA) uit het testmateriaal.

  Bij het analyseren van RNA moet de codesequentie van het ribonucleïnezuur eerst worden omgezet in een DNA-codesequentie, wat moet worden gedaan met het enzym "reverse transcriptase" in een analytische stap vóór de eigenlijke amplificatie

• Amplificatie van het genetisch materiaal in verschillende stappen ("cycli"):

  • Stap één - "DNA-denaturatie": door het dubbelstrengs DNA te verhitten (95 ° C), wordt het gesmolten tot enkele strengen.
  • Stap twee - "Gloeien": bij een lagere temperatuur (ongeveer 55 ° C) kunnen de "primers" zich nu hechten aan hun DNA-doelsequenties.
  • Stap drie - "Verlenging": bij een temperatuur van 72 ° C verlengt het enzym Taq-polymerase nu ("verlengt") de startsequentie van de primer met behulp van zogenaamde "nucleotiden" (dit zijn de DNA-bouwstenen) en bouwt het op op deze manier een nieuw, langwerpig DNA-molecuul.

Omdat de stappen een tot en met twee in verschillende cycli worden herhaald, worden steeds langere nieuw gevormde DNA-ketens gecreëerd, en dat is waar de naam van dit laboratoriumproces "polymerasekettingreactie" vandaan komt.

• Analyse van de nieuw gecreëerde DNA-ketens (zogenaamde "PCR-producten"):

  Aan het einde van de kettingreactie (cycli) worden de PCR-producten - dus de nieuw gecreëerde DNA-moleculen - kwalitatief of kwantitatief onderzocht en geëvalueerd. Er zijn tal van mogelijkheden voor deze evaluatie zelf, veelal gebaseerd op het kleuren (vooral fluorescerende kleurstoffen) van het DNA en het zichtbaar maken (door middel van gelelektroforese of fotometrische fluorescentiedetectie)

Welke testresultaten levert de PCR op?

De resultaten van moderne PCR-methoden kunnen in twee groepen worden samengevat:

• kwalitatief en
• kwantitatieve resultaten.

Bij kwalitatieve PCR wordt onderzocht of een bepaald deel van het genetisch materiaal (DNA of RNA) in het testmateriaal aanwezig is (“positief” resultaat) of niet (“negatief” resultaat).

Kwalitatieve PCR wordt daarom voornamelijk gebruikt om de volgende diagnostische vragen te verhelderen ("ja / nee" resultaten):

• Diagnose van erfelijke ziekten,
• Verduidelijking van mutaties,
• Erkenning van genetische kenmerken (bijv. Aanleg voor bepaalde ziekten) etc.

De kwantitatieve PCR is een verdere ontwikkeling van deze laboratoriummethode, waarbij niet alleen de aanwezigheid van een bepaald gebied van het genetisch materiaal wordt gedetecteerd, maar tegelijkertijd ook de hoeveelheid genetisch materiaal. Dienovereenkomstig wordt kwantitatieve PCR voornamelijk gebruikt in de volgende medische gebieden:

• Als onderdeel van de infectiediagnose kan de hoeveelheid pathogenen in het lichaam van de patiënt nauwkeurig worden bepaald. In het geval van virusinfecties wordt deze PCR-methode gebruikt om de zogenaamde

  Virale lading onderzocht

Bovendien is kwantitatieve PCR ook erg belangrijk in fundamenteel onderzoek, waarbij niet alleen de menselijke geneeskunde, maar ook een aantal andere wetenschappelijke gebieden (diergeneeskunde, biochemie, biologie, enz.) Profiteren van dit proces.

Het voordeel van PCR bij de diagnose van infectieziekten is dat de testresultaten van deze laboratoriummethode extreem snel beschikbaar zijn (meestal binnen één werkdag). Bovendien is de PCR een zeer gevoelige laboratoriummethode. Dit betekent dat zelfs de kleinste hoeveelheden bacteriën of virussen in het testmateriaal tot een betrouwbaar positief resultaat leiden.

Zijn er verdere ontwikkelingen in conventionele PCR?

Een bijzondere verdere ontwikkeling van de PCR-methodiek is de

Multiplex PCR

Bij multiplex PCR worden meerdere DNA-targetsequenties (lees: meerdere primers) tegelijkertijd gebruikt. Hierdoor ontstaat een mix van PCR-producten die dienovereenkomstig moeten worden gedetecteerd en beoordeeld.

Multiplex PCR wordt ook voornamelijk in de geneeskunde gebruikt

• menselijke genetica
• de infectie diagnose.

Het voordeel van deze methode is dat er in totaal minder testmateriaal van de patiënten gehaald hoeft te worden en in één analysestap een serie testresultaten gecreëerd kan worden. Deze voordelen met betrekking tot diagnostiek worden echter in veel gevallen gecompenseerd door de hoge prijs voor analyse.

Een andere specialiteit voor het gebruik van PCR is het laboratoriumproces van

DNA sequentie

Dit is een diagnostische mogelijkheid om de exacte volgorde van de genetische code bij een patiënt te ontcijferen. De sequentiemethode kan ook gebaseerd zijn op PCR-technologie.

Omdat sequencing echter aanzienlijk complexer en kostenintensiever is dan conventionele PCR-methoden, is het momenteel gereserveerd voor speciale diagnostische (uitgebreide genoomanalyses) en wetenschappelijke vragen.

Wat zijn de belangrijkste toepassingsgebieden voor PCR?

Met betrekking tot de toepassingsgebieden van PCR in de menselijke geneeskunde wordt deze laboratoriumprocedure gebruikt voor de volgende diagnostische vragen:

• Verduidelijking van erfelijke ziekten - er zijn al PCR-methoden voor meer dan 600 verschillende erfelijke ziekten.
• Farmacogenetica - door genetische kenmerken van het levermetabolisme te bestuderen, kunnen conclusies worden getrokken over de effectiviteit en dosering van geneesmiddelen.
• Tumorgeneeskunde ("oncologie") - hier wordt enerzijds PCR gebruikt om risicofactoren voor bepaalde tumorziekten (bijv. Borstkanker) op te helderen. Anderzijds kunnen cellen en weefsels in reeds opgetreden tumoren ook worden onderzocht op verschillende mutaties, die met name bij de behandeling van deze ziekten een steeds belangrijkere rol spelen.
• Forensische geneeskunde ("forensisch onderzoek") - hier is de PCR van groot belang in bijvoorbeeld vaderschapsprocedures en in de criminologie ("DNA-vingerafdrukken").
• Infectiegeneeskunde - PCR heeft een onmisbare waarde bij de diagnose, progressie en therapiecontrole van bacteriële, virale en parasitaire infectieziekten.

Zie Kanker voor meer informatie over kanker.

Zijn er referentiewaarden voor PCR-testresultaten?

Met betrekking tot referentiewaarden in PCR-methoden moet altijd rekening worden gehouden met de desbetreffende diagnostische vraag. Aangezien bepaalde genetische kenmerken worden gedetecteerd als onderdeel van een onderzoek naar erfelijke ziekten (bijv. Mutatieanalyse), is er geen referentiewaarde ('positief' of 'negatief') in dergelijke laboratoriumanalyses, net zoals er geen referentiewaarde is voor bijvoorbeeld haarkleur. Omdat haarkleur ook een genetisch kenmerk is.

Bovendien zijn laboratoriumanalyses voor aangeboren erfelijke eigenschappen in dit land onderworpen aan strikte voorschriften, waarvoor de bepalingen van de Oostenrijkse wet op genetische manipulatie (GTG) doorslaggevend zijn (bepaling van een bestaande ziekte volgens §65 GTG). Bijgevolg mag deze analyse pas door het medisch laboratorium worden uitgevoerd na schriftelijke bevestiging van de te onderzoeken persoon, de wettelijke voogd (in het geval van minderjarigen die niet in staat zijn om een beslissing te nemen) of de wettelijke vertegenwoordiger (in het geval van personen die meerderjarig zijn die niet in staat zijn om beslissingen te nemen) over de uitgebreide informatie verstrekt door behandelend arts moet worden uitgevoerd met betrekking tot deze genetische test (artikel 69 GTG).

Bovendien hebben patiënten doorgaans het recht om te verbieden dat genetische tests op zichzelf worden uitgevoerd.

Voor niet-menselijke genetische PCR-laboratoriumanalyses gelden echter veel minder strikte voorschriften. Het betreft veelal laboratoriummethoden op het gebied van infectiediagnose.

Bij de referentiewaarden van deze laboratoriummethoden moet onderscheid worden gemaakt tussen kwalitatieve en kwantitatieve methoden:

Kwalitatieve PCR-methoden leveren doorgaans een 'positief' of 'negatief' resultaat op, waarbij 'negatief' meestal de referentiewaarde is

Met de kwantitatieve PCR-methode worden, afhankelijk van de methode, passende drempelwaarden (zogenaamde "cut-offs") gedefinieerd vanaf het moment dat een resultaat als pathologisch moet worden beoordeeld.